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研域攻略：怎么防止抗體遭受再難？
發(fā)布時(shí)間： 2019-08-14 點(diǎn)擊次數(shù)： 1705次抗體問(wèn)題一向困擾著廣闊科研工作者，抗體市場(chǎng)魚(yú)龍混雜，雖然是一個(gè)姓名但是每一個(gè)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量都是不同的。小編今日給大家共享一些抗體挑選的經(jīng)歷~
檢測(cè)任何目的靶蛋白都有不止一種抗體可供挑選，為縮小抗體的挑選范圍選中適宜的抗體，需求考慮如下幾種因素：
1. 剖析或使用的類型
一般抗體說(shuō)明書(shū)都列出該抗體經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證過(guò)適用于何種剖析類型，如：能夠使用于 WB IHC ICC ELASA 剖析等，假如抗體說(shuō)明書(shū)沒(méi)有提及的使用類型，并不意味著該抗體不適用于此種剖析使用類型，而僅是說(shuō)明尚未通過(guò)此種剖析實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，假如抗體不適用某些剖析實(shí)驗(yàn)，則會(huì)在抗體說(shuō)明書(shū)上標(biāo)明出來(lái)不適于某剖析實(shí)驗(yàn)。
2. 樣本蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)
了解樣本蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)有助于挑選適宜的抗體，至少兩方面因素需求考慮，待測(cè)樣本蛋白的結(jié)構(gòu)域：抗體是由各種不同免疫原免疫宿主而制備得來(lái)，其中的免疫原包含：全長(zhǎng)蛋白、蛋白片斷、多肽、全有機(jī)體或細(xì)胞，抗體說(shuō)明書(shū)一般都有免疫原的描繪，假如計(jì)劃?rùn)z測(cè)的是蛋白片斷或一種特別的同型物或蛋白全長(zhǎng)的某一區(qū)域，則必須挑選用含此片段域的免疫原制備出的抗體。假如計(jì)劃用 FACS 流式檢測(cè)活細(xì)胞的外表蛋白，則需求挑選含該外表蛋白的胞外域來(lái)免疫制備的抗體。
樣本的提取或處理進(jìn)程：某些抗體要求樣本通過(guò)某些特別處理，例如：許多抗體只辨認(rèn)復(fù)原和變性的、表位已露出不受二級(jí)四級(jí)結(jié)構(gòu)阻止的蛋白樣本，另一方面，某些抗體僅辨認(rèn)天然折疊狀況的蛋白。當(dāng)挑選免疫組化的抗體時(shí)，應(yīng)注意某些抗體只辨認(rèn)未固定的冷凍的安排，而另一些抗體則適用于無(wú)需抗原修正的甲醛固定石蠟包埋的安排，這些都會(huì)在抗體說(shuō)明書(shū)上使用部分標(biāo)明出來(lái)。
3. 樣本的物種
應(yīng)挑選物種相同或有穿插反響的抗體，抗體可能與不同物種的同種靶蛋白有穿插反響，因其氨基酸序列同源性較高，假如樣本的品種未列入抗體說(shuō)明書(shū)上的穿插反響種屬表中，并不意味著該抗體不適用于檢測(cè)該物種的蛋白，而僅僅表明該物種尚未用此抗體檢測(cè)驗(yàn)證過(guò)，應(yīng)通過(guò)序列比對(duì)的方法來(lái)猜測(cè)穿插反響，可使用 Expasy 和 NCBI BLAST 來(lái)進(jìn)行不同物種蛋白同源性比對(duì)。
4. 抗體宿主的品種
一抗的挑選
一般說(shuō)來(lái)，在使用偶聯(lián)二抗結(jié)合無(wú)偶聯(lián)物的一抗時(shí)，一抗宿主動(dòng)物的物種挑選較為重要，對(duì)于免疫組化而言，盡可能挑選與樣本不同種系物種的一抗，從而防止二抗與樣本內(nèi)源性免疫球蛋白產(chǎn)生穿插反響，例如：檢測(cè)小鼠樣本蛋白，則不應(yīng)挑選小鼠或大鼠源的一抗，選兔源的一抗，則二抗則可挑選偶聯(lián)了檢測(cè)分子的抗兔 IgG。
假如挑選有偶聯(lián)物的一抗則不適用上述情況，除免疫組化外的其它對(duì)不含內(nèi)源性免疫球蛋白樣本的檢測(cè)方法，則抗體宿主物種的影響不大，如對(duì)不含 IgG 的細(xì)胞裂解物樣本的 western blotting 檢測(cè)，盡管如此，含有血清的安排裂解物和安排培養(yǎng)上清中含有免疫球蛋白，復(fù)原變性樣本中含IgG，在western blot 檢測(cè)中則結(jié)合呈現(xiàn) IgG 分子50 and 25 kDa 的重鏈和輕鏈條帶。
二抗的挑選
二抗應(yīng)選用與使用的一抗相同的物種來(lái)歷，例如：假如你的一抗是小鼠的單克隆抗體，二抗則選抗小鼠的二抗 anti-mouse secondary 。建議查看二抗說(shuō)明書(shū)確保該抗體適用于你的檢測(cè)使用， 二抗一般銜接熒光素 FITC 或發(fā)光團(tuán)。
兩層染色抗體的挑選
兩層染色抗體的挑選用未偶聯(lián)一抗進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)物或安排切片的兩層免疫染色要求一抗來(lái)歷于不同物種而且二抗別離辨認(rèn)其中之一，二抗說(shuō)明書(shū)應(yīng)描繪其與其它物種來(lái)歷的免疫球蛋有否有穿插吸附。